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乐山PCR实验室值得信赖「英瀚斯」苍井空黄色电影
2024-03-07 12:23  浏览:45
3分钟前 乐山PCR实验室值得信赖「英瀚斯」[英瀚斯2eefa30]内容:

蛋白提取

大部分蛋白质都可溶于水、稀盐、稀酸或碱溶液, 少数与脂类结合的蛋白质则溶于乙醇、丁醇等有ji溶剂中,因些,可 采用不同溶剂提取分离和纯化蛋白质及酶。

(一)水溶液提取法

稀盐和缓冲系统的水溶液对蛋白质稳定性好、溶解度大、是提取蛋白质常用的溶剂,通常用量是原材料体积的1-5倍,提取时需要均匀的搅拌,以利于蛋白质的溶解。提取的温度要视有效成份性质而定。ELISA是一种结合抗原、抗ti特异性反应和酶对底物高xiao催化作用的高敏感性免yi学实验技术。一方面,多数蛋白质的溶解度随着温度的升高而增大,因此,温度高利于溶 解,缩短提取时间。但另一方面. ,温度升高会使蛋白质变性失活,因此,基于这一点考虑提取蛋白质和酶时一般采用低温( 5度以下)操作。为了避免蛋白质提以过程中的降解,可加入蛋白 水解酶抑zhi剂(如二yi丙基氟磷酸,碘yi酸等)。

染色质免l疫共沉淀技术(ChIP)

基于体内分析而发展的染色质免l疫沉淀分析Chr omat in immunoprecipitat ionassay kit, ChIP)技术可以真实、完整地反映结合在DNA序列上的调控蛋白。由于ChIP采用甲醛固定活l细胞或者组织的方法,因此能比较真实的反映细胞内TF与Promoter的结合情况,还可以用来研究组蛋白的各种共价修饰与基因表达的关系。此外,Illumina还捕获了未翻译的区域,这是NimbleGen和安捷伦平台无法靶定的。近年来,这种技术得到不断的发展和完善。采用结合微阵列技术在染色体基因表达调控区域检查染色体活性,是深入分析癌l症、心血l管病以及中央神经系统紊乱等疾病主要通路的一-种非常有效的工具。

染色质免l疫沉淀分析(ChIP) 的基本原理是在活l细胞状态下,当用甲醛处理时,相互靠近的蛋白与蛋白、蛋白与核酸(DNA或RNA)之间会产生共价键。细胞内,当F与Promoter相互结合时,它们必然靠的比较近或者契合在一起,这个时候用甲醛处理,能使它们之间产生共价键。有丝分裂过程中DNA链之间的错配引起的fu制滑动被认为是导致STR产生的较为常见原因,并且依据不同fu制单元大小的不同以及不同物种之间,fu制滑动发生的概率也不相同。固定的蛋白质DNA复合物通过超声或酶处理将其随机切断为-定长度范围内的染色质小片段然后通过抗原抗l体的特异性识别反应沉淀此复合体,特异性地富集目的蛋白结合的DNAl片段,通过对目的片断的纯化与检测,从而获得蛋白质与DNA相互作用的信息。通过qPCR或二代测序,筛选与目的蛋白互作的未知DNA信息。

RIP

技术概述

RIP是研究体内蛋白与RNA互作的重要技术。在同样获得80M测序数据的情况下,NimbleGen有97%的目标序列达到10x以上的测序深度,而其他产品只有90%。该技术先用甲醛等试剂交联细胞内的“蛋白-RNA”互作复合物,裂解细胞后,用靶蛋白特异的抗l体(或标签抗l体)做免l疫沉淀,获得“靶蛋白-RNA”互作复合物,去交联分离其中的RNA;针对预测的靶蛋白结合RNA的序列设计引物,

做qPCR实验,验证预测的RNA是否与靶蛋白有结合,或者将分离出来的RNA做高通量测序,筛选到可能与靶蛋白结合的RNA。

技术流程

细胞交联-→细胞裂解-→免l疫共沉淀→去交联→RNA分离→建库→高通量测序(或qPCR)。

18.引物是经过PAGE纯化的,为什么还有碱基缺失或插入?

答:理论上分析型PAGE变性电泳,可以区分引物之间一个碱基的差别。但是制备PAGE电泳,上样量都是非常大,电泳时的条带非常宽,带与带之间有重叠,分辨率已下降,电泳后割带回收目的引物时,很难说不割到差别仅几个碱基的引物。随后设计BSP引物进行PCR,在扩增过程中尿嘧定全部转化为胸腺嘧定,zui后对PCR产物进行测序就可以判断CpG位点是否发生jia基化,称为BSP-直接测序法。国内有一个不好的现象,PAGE纯化的引物,特别是长引物要的量都比较高,导致割的条带有时可能比较宽。建议:您如果减少OD数,引物遇到的问题可能就会少一些。

19. TaqMan 探针设计的基本原则是什么?

答:下列原则供您参考。

◆TaqMan 探针位置尽可能靠近扩增引物(扩增产物50-150bp),但不能与引物重叠。

◆长度一般为18-40mer 。

◆G-C含量控制在40-80%左右。

◆避免连续相同碱基的出现,特别是要避免GGGG或更多G出现。

◆在引物的5'端避免使用G。

◆选用比较多的碱基C。

◆退火温度Tm控制在 68-70C 左右。

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